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目的
研究肺表面活性物质蛋白(surfactantprotein，SP)-C基因多态性，尤以外显子4(TN)、5(SN)位点为重与内蒙古地区蒙古族新生儿呼吸窘迫综合征(neonatalrespiratorydistresssyndrome，NRDS)的关系。
方法
采用前瞻性研究方法，选择51例NRDS患儿(病例组)与51例正常新生儿(对照组)作为研究对象，应用PCR基因分析技术检测候选基因SP-C外显子4和5有无突变现象，并检测外显子4(TN)、5(SN)位点基因多态性，分析多态性与NRDS的关系。
结果
SP-C外显子4和5未发现基因突变现象。在内蒙古地区蒙古族，SP-C外显子4(TN)位点均可检出3种基因型：即AA、AC及CC型，SP-C外显子4(TN)位点基因多态性病例组与对照组相比差异无统计学意义(χ2＝0.，P＝0.)。外显子5(SN)位点可检出3种基因型：即AA、AG及GG型，SP-C外显子5(SN)位点基因多态性病例组与对照组相比差异无统计学意义(χ2＝0.，P＝0.)。
结论
内蒙古地区蒙古族新生儿SP-C基因型及等位基因频率与性别、出生体重、胎龄、生产方式等无明显关联。内蒙古地区蒙古族NRDS患儿的SP-C外显子4和5未发现基因突变现象。SP-C基因外显子4(TN)、外显子5(SN)位点基因多态性未发现与内蒙古地区蒙古族NRDS患儿有相关性。
新生儿呼吸窘迫综合征(neonatalrespiratorydistresssyndrome，NRDS)是新生儿期最常见的危重症之一，是以进行性呼吸困难为主要表现的临床征候群[1,2]。NRDS不仅是导致早产儿疾病与死亡的最主要原因，还是支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia，BPD)的主要原因[3,4]。NRDS发病主要机制是因为缺乏肺表面活性物质，导致肺泡表面张力增加，引起肺泡的逐渐萎陷，从而导致进行性肺不张[5]。肺表面活性物质主要成分是磷脂，其次是肺表面活性物质蛋白(surfactantprotein，SP)，SP有4种，SP-A、SP-B、SP-C与SP-D，在肺表面活性物质的功能和代谢等方面有着非常重要的作用[6,7]。目前国内外很多研究报道，NRDS的发生与肺表面活性物质中SP合成减少有很大的关系。近年来，因SP基因多态性或突变导致SP缺乏与NRDS相关性的研究已经成为一个重要的研究方向；研究发现，SP-C基因突变与NRDS有关[8]。本研究选择内蒙古地区蒙古族NRDS患儿，着重研究以下2个方面内容：(1)NRDS患儿SP-C基因序列有无突变发生；(2)蒙古族NRDS患儿与对照组之间SP-C基因外显子4(TN)、5(SN)位点基因多态性的比较。
1 对象与方法
1.1 研究对象
病例组：年9月至年12月于内医院新生儿病房住院的蒙古族NRDS患儿51例。NRDS的诊断依据第7版《儿科学》NRDS诊断标准[9]。对照组：年9月至年12月于内医院新生儿病房住院的未发生NRDS的蒙古族患儿51例。对照组纳入标准：(1)X线胸片提示无肺部感染和NRDS表现；(2)血常规和C反应蛋白提示无明确感染者。
排除标准：病例组和对照组均排除：(1)严重先天性疾病，如复杂型先天性心脏病、膈疝和脑发育不良等；(2)遗传代谢性疾病，如苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下和糖尿病等；(3)母亲孕后期有明确感染史；(4)多胎；(5)母亲糖尿病；(6)生后窒息。本研究通过内蒙古医科大学伦理委员会批准及家属知情同意。
1.2 方法
1.2.1 标本采集及临床资料收集
抽取NRDS患儿及正常新生儿0.5ml静脉血，置于EDTA管中抗凝，–80℃冰箱保存，2～4周取基因组DNA。收集患儿性别、出生体重及胎龄等相关临床资料。
1.2.2 基因组DNA的提取
取出冻存全血样本放置在冰上；融化后颠倒混匀稍离心，各取μl混匀的全血放置在1.5ml离心管中冰上备用并标记，其余全血–80℃冻存。使用TIANampBloodDNAKit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型-目录号：DP)进行基因组DNA提取。使用前在缓冲液GD和漂洗液PW中加入适量无水乙醇并标记备用。将装有μl抗凝全血的1.5ml离心管放置在试管架。加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。加μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10～30min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮，延长裂解时间至溶液清亮为止)。加μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，10r/min(g)离心(离心半径0.cm)30s，依次向吸附柱CB3中加入μl缓冲液GD、μl漂洗液PW和μl漂洗液PW，每次加试剂后均需10r/min(g)离心30s，每次均需倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。随后再次10r/min(g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，滴加70μl去离子水，室温放置2～5min，10r/min(g)离心2min，将溶液收集到离心管中。将离心管中收集的溶液(即提取出的DNA)标记放置在冰上或冻存备用。
1.2.3 PCR扩增
SP-C基因全长分段扩增，每一对引物可扩增长度为bp，引物委托北京安美生医药科技有限公司合成。依据引物说明书配置成μmol/μl储存液，–20℃保存。分别取20μl引物储存液加入80μl的灭菌超纯水配置成20μmol/μl的PCR工作液备用。使用TAKARAPCRAmplificationKit(CodeNo.：DR)进行PCR实验。从–20℃取出DNA样本、引物工作液、PCRAmplificationKit放置在冰上，融化后轻轻混匀，离心备用；按下列组成配制PCR反应液：10×PCR缓冲液5μl，dNTPMixture4μl，引物F0.5μl，引物R0.5μl，TaKaRaTaq0.25μl，DNAng～1μg，加灭菌蒸馏水至总体积50μl。SP-C基因片段扩增的PCR反应条件：94℃10min，94℃40s，56～62℃30s，72℃40s，72℃7min，38cycles，4℃保存备用。
1.2.4 应用PCR基因分析技术对候选基因SP-C外显子4、5全基因进行序列测定
取待测序样本及上下游引物各20μl，干冰保存寄送至北京安美生医药科技有限公司对SP-C外显子4、5全基因进行序列测定。测序数据分析：应用NCBI数据库中的BLAST应用程序，将测序结果与数据库中的SP-C基因序列进行比对，确定是否存在突变的碱基及SP-C基因外显子4(TN)、5(SN)位点基因多态性。
1.3 统计学分析
使用SPSS13.0统计软件进行统计学相关性分析。两组性别、出生方式、是否规律促肺成熟及生产方式的比较采用卡方检验，两组胎龄、出生体重分布采用t检验；有关SP-C基因外显子4(TN)、5(SN)位点基因多态性的比较均采用卡方检验，P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况比较
病例组患儿51例，其中男31例，女20例；剖宫产28例，经产道娩出23例；胎龄29～41周，出生体重1～g；规律促肺成熟35例，未规律促肺成熟16例。对照组患儿51例，其中男25例，女26例；剖宫产20例，经产道娩出31例；胎龄30～40周，出生体重～3g；规律促肺成熟30例，未规律促肺成熟21例。两组患儿性别、胎龄、出生体重、出生方式、是否规律促肺成熟等方面比较差异均无统计学意义(P0.05)，见表1。
表1
两组患儿一般情况比较
2.2 NRDS患儿SP-C基因序列有无突变
实验通过基因测序方法对SP-C外显子4和5进行基因测序，未发现基因突变现象，见图1、图2。
图1
肺表面活性物质蛋白-C基因外显子4测序图
图2
肺表面活性物质蛋白-C基因外显子5测序图
2.3 SP-C基因外显子基因多态性碱基序列图
SP-C基因外显子4(TN)、5(SN)位点基因多态性碱基序列见图3、图4。
图3
肺表面活性物质蛋白-C基因外显子4(TN)位点基因多态性碱基序列
图4
肺表面活性物质蛋白-C基因外显子5(SN)位点基因多态性碱基序列
2.4 两组SP-C基因外显子4(TN)、5(SN)位点基因多态性的比较
病例组与对照组相比，两组SP-C基因外显子4(TN)位点均可检出3种基因型：即AA、AC及CC型。其中，病例组此3种基因型频率分别为：21.6%、35.3%和43.1%，A等位基因频率为39.2%，C等位基因频率为60.8%。对照组3种基因型分别为17.6%、41.2%和41.2%，A等位基因频率为38.2%，C等位基因频率为61.8%。SP-C基因外显子4(TN)位点等位基因及基因型的比较两组间差异无统计学意义(P0.05)，见表2。
表2
SP-C外显子4(TN)等位基因及基因型在两组患儿的分布[例(%)]
病例组与对照组相比，两组SP-C基因外显子5(SN)位点均可检出3种基因型：即AA、AG及GG型。其中，病例组此3种基因型频率分别为：19.6%、33.3%和47.1%，A等位基因频率为36.3%，G等位基因频率为63.7%。对照组3种基因型分别为23.5%、27.5%和49.0%，A等位基因频率为37.3%，G等位基因频率为62.7%。SP-C基因外显子5(SN)位点等位基因及基因型的比较两组间差异无统计学意义(P0.05)，见表3。
表3
SP-C外显子5(SN)等位基因及基因型在两组患儿的分布[例(%)]
3 讨论
肺表面活性物质随着胎儿胎龄的增加而被发育性调节，胎儿胎龄在15周时就可以在细支气管检测到SP-B和SP-C的mRNA，24～25周开始合成磷脂和有活性的SP-B，直到胎儿胎龄到35周左右肺表面活性物质量才迅速增多，因此，早产儿胎龄如果小于35周则容易发生NRDS[10,11]。SP在肺表面活性物质的功能和代谢等方面有着非常重要的作用。虽然肺表面活性物质的替代药物治疗及其他支持治疗方法已经被广泛应用，疗效尚可，但是NRDS仍然是新生儿死亡的主要原因。多基因与多因素共同形成了发生NRDS的病因，目前认为基因调控可能在其发病中发挥更重要的作用。SP-C基因是到目前被发现仅表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞中的基因，肺的发育、激素水平、各类蛋白质转录因子及细胞因子等各方面的调节过程都会影响SP-C基因的正常表达[12]。SP-C基因突变可导致表达产物SP-C的合成发生障碍或结构出现异常[13]，从而导致婴幼儿各种肺疾病的发生。因此，推测SP-C基因的遗传多态性或突变可能与NRDS、BPD等多种肺疾病相关。芬兰有研究发现，SP-C外显子4(TN)与外显子5(SN)位点等位基因在男婴中与NRDS有相关性[8]。目前发现有数十种不同的SP-C基因突变，主要为错义突变，还有剪接位点突变和移码突变，以及小的缺失和插入，也可引起足月NRDS，危及生命。研究证实，SP-C基因突变与RDS和极早产有关，在极早产患儿中，SP-CAsn等位基因、Asn等位基因与NRDS相关[8]。
SP-C基因的遗传缺陷属于常染色体的显性遗传，可以伴有可变的外显率及严重性，可导致不同程度的肺受累表现，临床表现从轻度气急、呼吸窘迫，逐渐发展为呼吸衰竭，组织学上表现为反复肺不张、肺损伤和感染等[13]。1年，Nogee等[14]描述了第一个与肺部疾病有相关性的SP-C基因突变，他们发现了在同一个等位基因中导致外显子4的缺失及proSP-CC端区域37个氨基酸缺失的SP-C基因突变。随后其他SP-C基因突变被陆续报道，主要包括有移码突变、错义突变和剪接突变，还有插入突变和缺失突变，基因突变大多数位于外显子3、4和5上[15]。国内朱春梅等[16]通过研究婴幼儿肺间质疾病发现，SP-C基因在编码区位点发生的G→A杂合突变，位于外显子5区域，与婴幼儿肺间质疾病存在相关性。国外的研究发现了c.GA突变，在SP-C基因的外显子3的第密码子发生了GGC→AGC突变，引起甘氨酸被丝氨酸所替代，导致家族性肺纤维化[17]。SP-C基因的突变可造成其蛋白表达产物SP的合成障碍或蛋白结构的异常，而导致在婴幼儿中发生各类肺部疾病，尤其是与婴幼儿肺间质疾病的发生有非常密切的关系[18,19]。SP-C基因突变与儿童和成人间质性肺疾病有相关性，其发病机制被认为是错误折叠proSP-C导致细胞*性的累计所引起[20]。Wambach等[21]发现，SP-C基因转录降低会升高新生儿发生NRDS的危险性，升高NRDS的发生率。Bridges等[22]研究发现，过度表达的proSP-C突变体在转染细胞和转基因小鼠中可产生细胞*性，细胞内质网受压，最终致细胞慢性损伤、细胞死亡，导致慢性间质性炎症和肺纤维化，SP-C还参与了再摄取肺泡表面活性物质和分解代谢，同时肺泡中巨噬细胞的抗感染能力被激活[23]，上述可能是SP-C基因突变导致肺部疾病的原因，但是有待研究来进一步明确。
本研究
